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化學發(fā)光免疫分析儀基本結(jié)構(gòu)包括：進樣系統(tǒng)、反應系統(tǒng)、信號檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理與輸出系統(tǒng)，具體針對不同的免疫分析儀又可以細分為反應器傳送系統(tǒng)，測試包被物裝載系統(tǒng)，樣本裝載系統(tǒng)，條碼讀取系統(tǒng)，試劑裝載系統(tǒng)，加樣系統(tǒng)，溫育系統(tǒng)，清洗、分離系統(tǒng)，發(fā)光計數(shù)測量系統(tǒng)，計算機控制系統(tǒng)等。
加樣系統(tǒng)的機械結(jié)構(gòu)包括加樣探針、步進電機、機械臂、注射器、電磁閥門;電路系統(tǒng)包括電機驅(qū)動電路、液面探測傳感器、探針堵塞傳感器、位置傳感器以及管路系統(tǒng)等，是整個全自動化學發(fā)光中較為復雜的部分。其中主要的進樣裝置包括以下幾部分。
步進電機主要由步進電機運動控制器、步進電機驅(qū)動器和步進電機三部分組成，如圖2所示。
圖2、步進電機結(jié)構(gòu)圖
步進電機驅(qū)動器主要包括環(huán)形分配器和功率放大器兩部分。其中環(huán)形分配器又稱脈沖分配器，它根據(jù)運行指令按一定的邏輯關系分配脈沖，通過功率放大器加到步進電機的各相繞組，使步進電機按一定的方式運行，并實現(xiàn)正、反轉(zhuǎn)控制和定位控制。
步進電機運動控制器是控制系統(tǒng)的核心部分，它根據(jù)控制要求提供給步進電機驅(qū)動控制信號，該控制信號包括脈沖信號、脈沖方向信號、控制模式信號。為了控制的方便，步進電機一般有兩種不同的控制模式可供選擇。一種是方向/脈沖模式，在這種控制模式下，脈沖信號控制的是步進電機的運動，脈沖方向信號控制的是步進電機的運動方向(即正、反轉(zhuǎn));另一種是脈沖模式，此時這兩路信號分別控制步進電機的正轉(zhuǎn)和反轉(zhuǎn)運動，這樣對于某些只需要一個方向運動的應用場合，可以省去一路信號，簡化設計。
2、檢測器探頭
當探針與反應試劑瓶中溶液接觸后即發(fā)生化學發(fā)光，發(fā)射出的光在密封箱中被激發(fā)，光子被收集。圖3是探頭的結(jié)構(gòu)。
圖3、探頭結(jié)構(gòu)示意圖
a、固定架;b、導光管;c、引發(fā)液入口端;d、可使探頭定位于反應試劑瓶上端的輪蓋;e、光電倍增管;f、光電倍增管夾持器和流體管道;g、零部件支撐板;h、流體和檢測器組件的蓋板;i、光電倍增管插孔;j、光電倍增管夾持器;k、引發(fā)液輸送線
3、注射器
手動注射器進樣多出現(xiàn)在管式化學發(fā)光儀器中，主要靠注射時的沖力使之混勻，在靜態(tài)下測定化學發(fā)光信號。注射器進樣過程中試劑混合是一個快速的濃度變化的瞬時過程，測量精度主要體現(xiàn)在體積的控制，注射的時間和壓力分布上。
自動進樣注射系統(tǒng)主要應用于全自動或者半自動的化學發(fā)光免疫分析儀器上，有兩種類型的注射器可以使用，活塞式或風箱式。針筒一般為玻璃材質(zhì)，通過筒徑大小，實現(xiàn)各種不同的滿程容量。注射系統(tǒng)的設計要求從試劑容器到注射噴嘴的總的死體積盡可能的小，不同儀器間的死體積差別較大，最小的可小于500μL，多的可至1.5mL。5000μL的注射器泵在探針清洗時動作，可以對探針的管路施以較高的壓力以及較大的液體流量，使探針得到徹底清洗，避免了試劑與樣本之間、不同樣本之間以及不同試劑之間的交叉污染。一個理想的注射器可以在一個較寬的范圍內(nèi)具有高精度的體積設定和可調(diào)的壓力分布。
4、蠕動泵
采用蠕動泵將樣品從試劑瓶中直接泵入反應池，通過流通池的設計使反應液在光電倍增管前瞬時混合，可以實現(xiàn)對閃光型和輝光型的化學反應的測定。
流動注射分析技術的建立，突破了幾百年來分析化學反應必須在物理化學平衡條件下完成，使非平衡條件下的化學分析成為可能，從而開發(fā)出分析化學的一個全新領域。流動注射作為一種自動化、簡便易操作的進樣和分離富集技術，其與化學發(fā)光技術聯(lián)用，已成為一種新型有效的自動微量化分析技術，并且同時具有實時、在線分析的特殊功能，在生命科學、醫(yī)學、環(huán)境檢測和食品質(zhì)量監(jiān)督等多領域有著廣闊的應用前景。
在化學發(fā)光分析中，樣品的混合狀況是影響靈敏度的一個關鍵條件。因此，反應器(包括樣品裝載系統(tǒng)和反應杯裝載系統(tǒng))的設計就成了所有化學發(fā)光儀器的重要因素。商品化的化學發(fā)光儀器的反應器主要有管式和微孔板兩種。
1、管式反應器
主要用于靜態(tài)化學發(fā)光免疫分析，多采用注射器將底物和引發(fā)劑能夠以精確的時間加入，這對于一個隨時間光信號產(chǎn)生變化的動力學樣品來說很有必要。玻璃和透明、半透明的塑料管和比色皿是化學發(fā)光測試比較理想的材料。理想的是光能夠通過一個平面然后測試，以減少邊際效應。
2、微孔板
為了滿足免疫分析快速、高通量的要求，樣本裝載系統(tǒng)一般要求同時裝載樣本60個以上，加樣探針可以隨時進入任意一個位置加樣。微孔板主要應用于化學發(fā)光免疫分析上，有96孔板以及384孔板等幾種。由于免疫分析從化學發(fā)光反應中發(fā)射出的光是各向同性的，即在各個方向上同等發(fā)射出來的。如果一個化學反應是在透明的微孔板中的微孔中進行，光不僅從垂直方向發(fā)散，還從水平方向發(fā)散出來。光很容易地通過各個孔之間的間隙和孔壁，光較強的孔就會干擾相鄰的孔。因此，化學發(fā)光測試一般用不透明微孔板。不透明的微孔板和板條主要有兩種：白色和黑色。白色或黑色板的選擇，主要是基于預期檢測信號的強弱，白色板主要用于較弱光的檢測，黑色板主要用于強光的檢測。黑色板還可以削弱非特異性結(jié)合所帶來的問題。
3、轉(zhuǎn)盤
轉(zhuǎn)盤一般包括樣本轉(zhuǎn)盤和試劑轉(zhuǎn)盤兩種。樣本轉(zhuǎn)盤上可根據(jù)需要放置多個可移動的托架，每個托架可放置多個樣本管。轉(zhuǎn)盤可旋轉(zhuǎn)360°，并能被條碼掃描器識別每個樣本管的條碼，并根據(jù)需要可將任意位置的血清管轉(zhuǎn)到加樣位置，并具有“剎車”裝置。操作者可在任意時間隨意更換樣本托架。試劑轉(zhuǎn)盤可同時裝載多種試劑。由于試劑對溫度的變化較為敏感，試劑轉(zhuǎn)盤需放置在冷卻倉內(nèi)，倉內(nèi)有內(nèi)置的冷藏冰箱將試劑保存4~8℃，探針加樣時轉(zhuǎn)盤在驅(qū)動電機的帶動下可移動到任意的位置;外置的條碼掃描器(與樣本轉(zhuǎn)盤共用)可將條碼信息掃描出并存儲于計算機內(nèi)，可方便操作者隨時將試劑取出或更換新的試劑。
4、包被珠托盤
設計上類似于試劑轉(zhuǎn)盤。由于包被珠為包被在玻璃珠上的抗體或抗原，對濕度較為敏感，長期在潮濕環(huán)境存放下容易變性，故將包被珠轉(zhuǎn)盤放在除濕倉內(nèi)(24h保持濕度小于20%)。每種包被珠都封裝在楔形的塑料盒內(nèi)，然后環(huán)形擺放在包被珠托盤上。安裝在包被珠轉(zhuǎn)盤旁的CCD條碼掃描器將條碼掃描后儲存到計算機中。根據(jù)需要，在加樣前，包被珠會轉(zhuǎn)動到相應的位置，在直流電機的推動下，將包被珠加到反應杯中去。
對輝光型化學發(fā)光免疫分析，以往的光信號檢測儀器大多采用光電二極管、光敏電池、電荷耦合器或者以光電流放大方式工作的常規(guī)光電倍增管作為檢測器件。隨著現(xiàn)代量子物理學的發(fā)展，以及人們對光的微觀特性認識的逐步深入，一種被稱為單光子計數(shù)器的新型高敏感度光檢測器被研制開發(fā)，其靈敏度及線性范圍均大大超過其他常規(guī)技術，其基本原理框架圖如圖4所示。
圖4、單光子計數(shù)器工作原理框架圖(來源：IVD分享庫)
其核心部件是光電倍增管，它是一個超高度真空的玻璃容器，其中向光的一面(稱為窗口)涂有一層特殊的具有光電效應的稀有金屬，稱為光陰極;而內(nèi)部還裝有多個以特殊方式排列的電極，稱為打拿極或加速極;其后部另有一個電極稱為樣機。上述各個電極之間均有直流電壓。
光電倍增管分為端窗型和側(cè)窗型兩種(圖5) 。側(cè)窗型的光電倍增管，從玻璃殼的側(cè)面接收入射光，而端窗型光電倍增管是從玻璃殼的頂部接收入射光。
圖5、光電倍增管
通常情況下，側(cè)窗型光電倍增管價格較便宜，大部分的側(cè)窗型光電信增管使用了不透明光陰極(反射式光陰極)和環(huán)形聚焦型電子倍增極結(jié)構(gòu)，這使其在較低的工作壓下具有較高的靈敏度。通常用在分立式化學發(fā)光儀器中，在分光光度計和通常的光度測定方面也有廣泛的使用;端窗型光電倍增管在其入射窗的內(nèi)表面上沉積了半透明光陰極(透過式光陰極)，使其具有優(yōu)于側(cè)窗型的均勻性。端窗型光電倍增管的特點還包括它擁有從幾十平方毫米到幾百平方厘米的光陰極，可以廣角度捕集入射光的大尺寸半球形光窗的光電倍增管。通常用在流動注射化學發(fā)光儀器以及免疫分析儀器中。
單光子計數(shù)器的工作示意圖如圖6所示：當光子打到光陰極時，由于光電效應，其表面可以產(chǎn)生能量微弱的游離電子，稱為光電子;該電子由于直流高壓的作用離開光陰極再次打到第一打拿極上，由于其獲得了直流高壓提供的能量，因而在第一打拿極上又制造出了能量更大、數(shù)量更多的電子，就這樣經(jīng)過多個打拿極的反復放大，最后使陽極產(chǎn)生了一個能量遠遠高于最初光子的電脈沖信號。該信號經(jīng)前置放大器放大，再經(jīng)過比較器去除噪聲信號，最后由分頻器換算出光子脈沖數(shù)。
圖6、單光子計數(shù)器的工作原理示意圖
放大器的作用是將光電倍增管陽極回路輸出的光電子脈沖(連同其他噪聲脈沖)線性地放大。放大器的增益可根據(jù)單光電子脈沖的高度和甄別器甄別電平的范圍來選定。另外還要求放大器具有較寬的線性動態(tài)范圍，上升時間≤3ns(即通頻帶寬過100MHz)，噪聲系數(shù)小等。
幾乎所有的化學發(fā)光免疫分析儀電信號的檢測都采用光子計數(shù)法，化學發(fā)光反應發(fā)出的光由光電倍增管轉(zhuǎn)為模擬信號，然后再經(jīng)由甄別電路轉(zhuǎn)變成數(shù)字信號發(fā)送給計算機的分析系統(tǒng)，分析系統(tǒng)根據(jù)標準樣品中的不同濃度的樣品發(fā)出不同的光子數(shù)進行線性回歸計算，得到樣品濃度和發(fā)光值之間的相關規(guī)律，擬合成函數(shù)表達式，再把待測樣品的發(fā)光值帶入相關函數(shù)中即可得到它的濃度值。信號的收集、傳輸以及計算機輸出過程如圖7所示。
圖7、化學發(fā)光免疫分析儀信號的收集、傳輸以及計算機輸出示意圖(來源：IVD分享庫)
1、光子計數(shù)器
光子計數(shù)器主要由放大器、甄別器和計數(shù)器構(gòu)成，各構(gòu)成部分的功能和工作原理如圖8所示。
圖8、光子計數(shù)器原理圖(來源：IVD分享庫)
①運算放大器
是一種多端元件。一般放大器的作用是把輸入電壓放大一定倍數(shù)后再輸送出去，其輸出電壓與輸入電壓的比值稱為電壓放大倍數(shù)或電壓增益。運算放大器是一種高增益(可達幾萬倍甚至更高)、高輸入電阻、低輸出電阻的放大器。它可以實現(xiàn)放大器、緩沖器、比較器、差分放大器、線路驅(qū)動器、積分器、電平轉(zhuǎn)換器、峰值檢波器、濾波器、光電二極管放大器等很多電路功能。
化學發(fā)光儀器中的測量放大電路需要將光電倍增管陽極輸出的微弱信號進行放大，再輸送到后續(xù)電路處理，這個功能主要是利用運算放大器來實現(xiàn)。運算放大器要求輸入電阻高、噪音低、穩(wěn)定性好、精度及可靠性高、線性度好，并有一定的抗干擾能力。簡單原理如圖9所示。
圖9、簡單運算放大器原理圖
②脈沖甄別器
有連續(xù)可調(diào)的閾電平，稱甄別電平。只有當輸入脈沖的幅度大于甄別電平時，甄別器才輸出一個有一定幅度和形狀的標準脈沖。在用于光子計數(shù)時，將甄別電平調(diào)節(jié)到單光電子峰的下限處，這時，各倍增極所引起的熱噪聲脈沖小于甄別電平而不能通過。這樣經(jīng)甄別器后只有光陰極形成的光電子脈沖和熱電子脈沖的輸出。對甄別器的要求是甄別電平穩(wěn)定，靈敏度高，死時間小。當有一脈沖觸發(fā)了甄別器中的線路以后，在它恢復原狀以前甄別器不能接受后續(xù)脈沖，這段時間稱為死時間，用于光子計數(shù)的甄別器的死時間要求小于10ns。
③計數(shù)器
計數(shù)器的作用是將甄別器輸出的脈沖累計起來并予以顯示。用于光子計數(shù)的計數(shù)器要滿足高計數(shù)率的要求，即要能夠分辨時間間隔為10ns的二脈沖，相應的計數(shù)率為100MHz。不過當光子計數(shù)器用于微弱光的測量時，它的計數(shù)率一般很低。因此采用計數(shù)率低于10MHz的計數(shù)器亦可。這部分還必須有控制計數(shù)時間的功能。
2、A/D轉(zhuǎn)換器
由于系統(tǒng)的實際對象往往都是一些模擬量(如溫度、壓力、位移、圖像等)，要使計算機或數(shù)字儀表能識別、處理這些信號，必須首先將這些模擬信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號;而經(jīng)計算機分析、處理后輸出的數(shù)字量也往往需要將其轉(zhuǎn)換為相應模擬信號才能為執(zhí)行機構(gòu)所接受。
將模擬信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號的電路，稱為模數(shù)轉(zhuǎn)換器(簡稱A/D轉(zhuǎn)換器或ADC，analog to digital converter);將數(shù)字信號轉(zhuǎn)換為模擬信號的電路稱為數(shù)模轉(zhuǎn)換器(簡稱D/A轉(zhuǎn)換器或DAC，digital to analog converter);A/D轉(zhuǎn)換器和D/A轉(zhuǎn)換器已成為信息系統(tǒng)中不可缺少的接口電路。
在化學發(fā)光免疫分析儀中，光電倍增管陽極出來的電流經(jīng)過運算放大器放大后，輸入A/D轉(zhuǎn)換器，把模擬信號轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號從電腦輸出。其中還要設計濾波電路降低噪聲信號。其簡單原理圖如圖10所示。
圖10、模擬采集電路示意圖(來源：IVD分享庫)
由于抗原抗體反應對溫度的穩(wěn)定性及溫度的范圍要求較高，反應溫度要求控制在37℃±0.2℃。基于精確度和精密度的需要，測量溫度的傳感器要有良好的線性范圍，前端采用橋式電路，然后不經(jīng)過放大直接連接到A/D轉(zhuǎn)換器上，應該采用高精度的A/D轉(zhuǎn)換器，在溫度的采集中一般對溫度的采集速率要求較低而對精度要求較高。系統(tǒng)中對溫度的控制采用通常傳統(tǒng)的PID算法，采用一片MSC1212作為微處理器對溫度進行控制。
清洗系統(tǒng)是異相免疫分析系統(tǒng)所必需的。在自動化的化學發(fā)光免疫分析儀器中，此系統(tǒng)是集成于儀器內(nèi)部的，在采用管式樣品池的化學發(fā)光免疫分析儀中，清洗系統(tǒng)一般是采用洗液針通過步進電機驅(qū)動從反應管中吸取廢液。
許多半自動的分析儀都配備一個洗板機來完成清洗功能。在全自動的儀器中，通常用吸管吸取。當樣本中的抗原(或抗體)以及試劑中的抗原(或抗體)與包被珠上的抗體(或抗原)反應完畢后，未參與反應的物質(zhì)需要被分離出去，通常采用的方法是用蠕動泵將未反應物直接吸掉，這種方法的缺點是不能將反應物吸干凈，大大降低了實驗的靈敏度。
目前多采用高速離心的方式(圖11)，將包被珠在反應杯中高速離心，離心過程中加水清洗，然后再離心，此過程反復5次。當對包被珠進行清洗時，下端的螺桿將包被珠推動上升到某一位置后，上端的離心電機前端正好頂住反應杯的口部，然后高速離心電機旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速可達8000r/min，多余的液體從而被排除到廢液槽內(nèi)。清洗過程中水泵加入蒸餾水到反應杯，然后再高速離心旋轉(zhuǎn)，將廢液徹底排掉。
圖11、高速離心示意圖
